技术步骤

（1）转染后24~48 h 收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30 min, 细胞裂解液于4 °C， 最大转速离心30 min后取上清；

（2）取少量裂解液以备免疫印迹分析，剩余裂解液中加入适量的相应抗体，4 °C缓慢摇晃孵育过夜；

（3）取10μL protein A 或G琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3,000 rpm离心3 min；

（4）将预处理过的10 μl protein A 或G琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4 °C缓慢摇晃孵育2~4 h，使抗体与protein A或G琼脂糖珠偶联；

（5）免疫沉淀反应后，在4 °C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1mL裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15 μL的3×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟；

（6）SDS-PAGE, 免疫印迹或质谱仪分析。

应用领域

研究细胞内蛋白质与蛋白质相互作用的一种技术。

服务周期

接到样本后1个月左右。

客户须知（对材料的要求、注意事项）

（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP-40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％ SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktail。

（2）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；

（3）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；

（4）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有一定风险。